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RAPD-Marker bei Malus x domestica (Apfel) und Pyrus communis (Birne) als Mittel zur Sortenidentifizierung - Teil I: Malus x domestica (Apfel)

Use of RAPD-Markers in Malus x domestica (apple) and Pyrus communis (pear) for cultivar identification - Part I: Malus x domestica (apple)

M. Stark-Urnau, Weinsberg

 

Zusammenfassung

Bisher wurde der Sortennachweis bei Äpfeln hauptsächlich über phänologische Bestimmungen durchgeführt, die zeitaufwändig und vegetationsgebunden sind. Durch die Verwendung der RAPD-PCR-Methode kann die Sortenidentifizierung hingegen innerhalb von vier Tagen mit geringem Aufwand an Material und technischen Geräten erfolgen. Bereits ein Blatt reicht für eine Analyse aus. Die RAPD-PCR-Methode kann zum Nachweis von Sorten dienen, indem DNA-Fingerabdrücke bereits identifizierter Sorten mit den Fingerabdrücken unbekannter Proben verglichen werden. Nach einem Vorscreening mit 26 Decamerprimern und 11 Apfelsorten wurden drei Primer ermittelt, die insgesamt 34 Fragmente lieferten. Die Fragmentlängen bei Einsatz dieser Primer betrugen zwischen 320 und 1750 Basenpaaren (bp). 26 RAPD-Loci (76,5%) wiesen Polymorphismen auf und die Fragmente, die von diesen Loci amplifiziert wurden, konnten als Marker für die Sortenidentifizierung verwendet werden. Auf diese Weise konnte unter Einsatz von nur drei RAPD-Primern 135 Apfelsorten und fünf Mutanten ihr sortentypischer DNA-Fingerabdruck zugeordnet werden.

Summary

Up to now distinguishing between different apple varieties has been mainly done by phenological means which is time consuming and depends on the vegetation period. Using the RAPD-PCR-method differentiation of apple cultivars can be cost effectively achieved within four days. Furthermore, one apple leave provides sufficient material for an analysis. RAPD/PCR provides an additional means to differentiate cultivars by comparing DNA-fingerprints of already identified cultivars with DNA-fingerprints of unknown cultivars. After screening 11 cultivars with 26 decamer primers, three primers were selected which produced a total of 34 fragments. The fragment lengths ranged from 320-1750 basepaires (bp). 26 RAPD loci (76,5%) exhibited polymorphisms and the fragments amplified from that loci were defined as markers suitable for cultivar-identification. Thus, as few as three RAPD-primers were sufficient to differentiate between 135 cultivars and five sports.

Keywords

RAPD-PCR, DNA-Fingerprinting, apple cultivars, apple, cultivar identification

 

Einleitung

Der Apfel (Malus domestica Borkh.) ist bereits seit Jahrhunderten ein beliebtes und gesundes Nahrungsmittel. Erste Sortenbeschreibungen gab es schon um 600 vor Christi. Bei der gegenwärtigen großen Vielfalt an Apfelsorten und Mutanten stellt die zuverlässige und schnelle Bestimmung von Apfelsorten ein erhebliches Problem dar. Eine kostengünstige molekulargenetische Methode zur Sortenidentifizierung könnte Fragen zur Identität bereits vor der vegetativen Vermehrung abklären und eine Grundlage für die Registrierung neuer Sorten bilden (Tancred et al. 1994).

Bislang wird die Sortenbestimmung beim Apfel üblicherweise anhand von Fruchtmerkmalen wie Ausprägung des Kelch- und Stielbereichs, Grund- und Deckfarbe, Fruchtform und Fruchtgröße durchgeführt. Für eine exaktere Sortenbeschreibung können auch phänologische Merkmale des Baumes mit in die Bestimmung aufgenommen werden. Diese Vorgehensweise der Sortenbestimmung ist sehr zeitaufwändig, da der Wuchs des Baumes und die Fruchteigenschaften in der Regel über mehrere Jahre beobachtet werden müssen, um eine hinreichende Sicherheit bei der Sortenbestimmung zu erreichen. Zusätzlich wird die Sortenbestimmung dadurch erschwert, dass zahlreiche Merkmale in Abhängigkeit von Standort und Unterlage eine erhebliche Schwankungsbreite aufweisen. Die Sortenbestimmung mittels genetischem Fingerabdruck (DNA-Fingerprinting) kann hingegen unabhängig vom Entwicklungsstand des Baumes durchgeführt werden, da bereits ein einzelnes Blatt für eine DNA-Analyse ausreichend ist. Nach der Gewinnung der DNA mittels Extraktion werden Teilbereiche der DNA vermehrt und auf einem Gel aufgetrennt (siehe Abbildung 1). Das „DNA-Fingerprinting" kann als Methode zum Sortennachweis dienen, indem DNA-Fingerabrücke bereits identifizierter Sorten mit den Fingerabdrücken unbekannter Proben verglichen werden.

   

             

Abbildung 1: Darstellung der möglichen Methoden zur Gewinnung genetischer Fingerabdrücke

Die Entwicklung von DNA-Markern an holzigen Pflanzen (DNA-Fingerprinting) ermöglichte die rasche Identifikation von Sorten und die Konstruktion genetischer Karten (Zyprian 1998). Zunächst wurde die „Restriction Fragment Lenght Polymorphisms" Methode (RFLPs) mit einigem Erfolg zur Sortenidentifizierung beim Apfel eingesetzt (Nybom et al. 1992). Die Technik ist jedoch sehr aufwändig und wurde bald von der RAPD/PCR Technik (random amplified polymorphic DNA-Polymerase-Kettenreaktion) überholt, bei der kurze Primer mit bis zu 10 Basen zum Einsatz kommen. Seit ihrer Einführung durch Williams 1990 erfreut sich die RAPD-Technik großer Beliebtheit, weil für ihren Einsatz keinerlei Kenntnisse über die Sequenz eines Genoms nötig sind. Die Polymorphismen resultieren aus Sequenzunterschieden, die dazu führen, dass eine Primerbindungen möglich oder aber nicht möglich ist. Deshalb werden die Polymorphismen durch Vorhandensein oder Abwesenheit bestimmter DNA-Fragmente dargestellt. Die Polymorphismen, die von einem Elternteil amplifizieren, nicht aber vom anderen, werden auf Mendel`sche Art und Weise vererbt (Warburton und Bliss 1996). Die RAPD/PCR-Methode erlaubt es, Polymorphismen bei eng verwandten Organismen zu entdecken und kann daher auch der Genkartierung oder phylogenetischen Studien dienen. RAPDs können aber auch sehr schwierig zu interpretieren sein, weil sie nur dominant-vererbte Marker zeigen und ihre Bandenmuster unterschiedlich stark gefärbt ausfallen können.

Im Gegensatz hierzu könnten „Simple - Sequence Repeat Markers" (Mikrosatelliten) eine noch zuverlässigere Methode für das „DNA-Fingerprinting" darstellen. Die Ursache liegt an der hohen Wiederholbarkeit von relativ einfachen Bandenmustern und an der co-dominanten Vererbung von Mikrosatelliten (Guilford et al. 1997). Die Verwendung von Mikrosatelliten setzt jedoch das Vorhandensein einer Genbank voraus und kostet wesentlich mehr Zeit und Geld als die RAPD/PCR-Methode. Zur Identifizierung von Sorten bei Kirsche, Pfirsich, Birne und Apfel ist die RAPD/PCR-Methode bereits vielfach erfolgreich eingesetzt worden (Gerlach und Stösser 1997, Warburton und Bliss 1996, Oliveira et al. 1999, Bell und Caine 1998, Koller et al. 1993, Morton et al. 1993). Da die RAPD/PCR-Methode sowohl sehr zeiteffektiv und kostengünstiger als andere molekulargenetischen Fingerprint-Methoden ist, als auch gering ausgeprägte genetische Variationen aufdecken kann (Warburton und Bliss 1996), wurde sie in dieser Arbeit eingesetzt.

Ziel der Arbeit war es, parallel zur phänologischen Bestimmung einer Apfelsorte entsprechende sortentypische RAPD-Marker festzulegen und eine kostengünstige und leicht reproduzierbare RAPD-PCR-Methode zu etablieren. Zur Erleichterung künftiger Sortenidentifizierungen sollte der persönliche genetische Fingerabdruck von 171 Apfelsorten und Mutanten bestimmt werden, um in Zukunft einerseits die Sortenechtheit und Reinheit des Pflanzmaterials aus Reiserschnittgärten überprüfen zu können und andererseits auch Sortenbestimmungen für private Interessenten zu ermöglichen.

Material und Methoden

Pflanzenmaterial: Junge frisch entfaltete Blätter von insgesamt 171 Apfelsorten oder Mutanten wurden in den Monaten Juni bis August gesammelt, gefriergetrocknet und bei -20°C gelagert. 146 Apfelsorten oder Mutanten stammten von phänologisch eindeutig charakterisierten Bäumen aus Baden-Württemberg (Standorte Augustenberg und Heuchlingen) und entsprechen dem Sortenspiegel des im Versuchsstandort Heuchlingen der Staatlichen Lehr- und Versuchsanstalt für Wein und Obstbau Weinsberg aufgepflanzten Sortenkontrollgartens. Zusätzliche 25 Streuobstsorten stammten aus Bayern Standort Triesdorf (siehe Tabelle 3).

Tabelle 3: Apfelsorten für die ein sortentypischer Fingerabdruck bestimmt worden ist

Apfelsorte (A-C)

Apfelsorte (C-G)

Apfelsorte (G-L)

Apfelsorte (L-R)

Apfelsorte (R-Z)

Adersleber Kalvill (T)

Cox
Orange Queen (H)

Grahams
Jubiläumsapfel (H)

Leipferdinger
Langstiel (A)

Ribston
Pepping (T)

Akane (H)

Croncels (H)

Granny Smith (H)

Linsenhofer (H)

Rote Stern-
renette (12/81) (H)

Alkmene (WeBest) (A)

Danziger Kantapfel (T)

Gravensteiner
Rellstab und Rot*(A)

Lohrer Rambour (T)

Roter
Eiserapfel (H)

Ananasrenette (H)

Delbarestivale (A)

Harberts Renette (T)

Lord Lambourne (H)

Roter Trierer
Weinapfel (T)

Arkcharm (A)

Delbarestivale
Ambassy (H)

Heslacher Luiken (H)

Mantet (A)

Roter
Herbstkalvill (T)

Arlet (A)

Delbarestivale* (H)

Hibernal (A)

Mauka (H)

Roter Berlepsch (A)

Astramel (A)

Discovery (H)

Holsteiner
Cox Esselborn (A)

Maunzenapfel (H)

Roter Boskoop (H)

Baumanns
Renette (Bonn) (T)

Duelmener
Rosenapfel (H)

Horneburger
Pfannkuchen (H)

Melrose (H)

Rubinette (H)

Bayh´s Mostapfel (H)

Early Smith (H)

Idared (WeBest) (A)

Minister von
Hammerstein (T)

Rubin (H)

Bellefleur,gelb (H)

Eberles Mostapfel (H)

Ingol (H)

Mutsu (H)

Schneiderapfel (A)

Bellefleur,rot (H)

Elstar * (H)

Ingrid Marie (H)

Mutterapfel (H)

Schöner aus Nord-
hausen (A)

Berlepsch,
gelb ( Best ) (H)

Engelsberger (H)

Jacob Lebel (A)

Öhringer
Blutstreifling (H)

Schweiz.Orangen-
apfel (A)

Berner Rosenapfel (A)

Fallstaff (H)

Jakob Fischer (H)

Oldenburg (H)

Shampion Klon A (A)

Bittenfelder (H)

Fiesta (A)

Jamba (A)

Ontario (H)

Shampion KlonB (A)

Blauacher Sämling
Wädenswil (H)

Florina (T)

James Grieve
Neumann (A)

Orleans Renette (H)

Signe Tillisch (T)

Blenheim
Orangenrenette (A)

Fromms Goldrenette (T)

Jerseymac (A)

Pia (A)

Sommerregent (A)

Blumbergs Langstiel (A)

Fuji, Nagafu Nr 6 (H)

Jonagold
BA/Wü (H)

Piflora (A)

Sonnenwirtsapfel (A)

Boikenapfel
(Öhringen) (T)

Gala Galaxy (H)

Jonagold* (A, H)

Pinova (H)

Stark Earliest (A)

Borowinka (T)

Gala* (H)

Jonathan Watson (A)

Prinz Albrecht (A)

Stina Lohmann (H)

Börtlinger
Weinapfel (H)

Gartenmeister
Simon (H)

Judaine (H)

Prinzenapfel (T)

Summerred (A)

Braeburn* (H)

Geflammter
Kardinal (T)

Judeline (H)

Rebella (H)

Taffetapfel (H)

Bramleys
Seedling (A)

Gehrers Rambour (H)

Kalco (T)

Red Winter (H)

Thurgauer
Weinapfel (H)

Brettacher (H)

Gelber Edelapfel (T)

Kanadarenette,
weiß (H)

Reichtragender
vom Zenngrund (T)

Trenklesämling (H)

Cadel Klon A (A)

Gewürzluiken (H)

Kardinal Bea (H)

Remo (H)

Vista Bella (A)

Champagner
Renette (H)

Glockenapfel (A)

Klarapfel (A)

Rheinischer
Winterrambour (H)

Wettringer
Taubenapfel (T)

Charlamowsky (T)

Gloster (A)

Krügers Dickstiel (H)

Rheinischer
Bohnapfel (H)

Wiltshire (T)

Clivia (W)

Golden Delicious (H)

Landsberger
Renette (H)

Rheinischer Krumstiel (H)

Zabergäu Renette (T)

Cox Orange * (A)

Goldparmäne
Klon B Ba-Wü (H)

Lausitzer Nelken-
apfel (A)

Riesenboiken (T)

Zuccalmaglio (H)

Die Herkunft der Blattproben ist mit (A, H, T) gekennzeichnet: A = Augustenberg, H = Heuchlingen und T = Triesdorf

* = die aufgeführten Mutanten haben den gleichen genetischen Fingerabdruck

Braeburn* = Braeburn Schneider, Braeburn Braebrite, Braeburn Standard 6458 A, Braeburn Hillwell; Cox Orange* = Cox Orange Ottensen, Cox Orange 1/11; Delbarestivale* = Delebarestivale RSG, Delbarestivale Celestre, Delbarestivale Delcorf; Elstar* = Elstar Daliter, Elstar Daliest, Elstar VO563, Elstar T1265 RSG, Elstar Rot, Elstar 719 Deutsch, Elstar Schmidt, Elstar Michelsen, Elstar Langfördern, Elstar Elswout, Elstar Elhof; Gala* = Gala Royal, Gala Mondial, Gala Brookfield; Gravensteiner*= Gravensteiner Rellstab, Gravensteiner Rot; Jonagold* = Jonagold Jonica, Jonagold 2361, Jonagold (Augustenberg), Jonagold 2381, Jonagold Wilmuta, Jonagold Rubinstar, Jonagold Jonagored10131, Jonagold Crowngold, Jonagold Earlyqueen, Jonagold Jonagored BS Herr

DNA-Extraktion: Die DNA-Extraktion erfolgte aus 20 mg lyophilisiertem Blattmaterial pro Probe. Das Blattmaterial wurde mit einem Mikropistill zermörsert und mit dem „Nucleon DNA Extraction Kit" (Nucleon Phytopure RPN 8510 von Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, BRD) extrahiert. Das Extraktionsprotokoll des „Nucleon DNA Extraction Kits" wurde folgendermaßen modifiziert: Dem Extraktionspuffer des Nucleon Extraction Kits wurden zusätzlich 10 mM ß-Mercaptoethanol und 20 µg/ml RNAse A zugegeben. Dann erfolgte eine 30 minütige Inkubation bei 37°C. Eine weitere Modifikation bestand in einer ein- bis zweistündigen stündigen Inkubation der Proben bei -20°C nach der Zugabe von Isopropanol und bevor die DNA durch Zentrifugieren pelletiert wird.

RAPD-Analyse: Die RAPD-PCR wurde mit den Ready-To-Go-RAPD-Analyse-Perlen von Amersham Biosciences (Freiburg, BRD) durchgeführt. Die Analyse-Perlen bestanden aus 1,5 Units Taq DNA-Polymerase, 10 mM Tris-HCl pH 9, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 und 200 µM jedes Nucleotids. Zusätzlich wurde den Proben noch steriles entionisiertes Wasser, 30 ng DNA und 1 µM Primer zugesetzt, so dass das Reaktionsvolumen 25 µl betrug. Es wurden insgesamt 26 Primer in einem Vortest eingesetzt und auf die Bildung zuverlässiger Marker-Fragmente zur Sortenidentifizierung untersucht. Die Primer Pharmacia 01-06 kamen von Amersham Biosciences, alle anderen Primer wurden bei Roth (Karlsruhe, BRD) in Form von Primer Sortimenten (Set 170) bestellt oder synthetisiert (siehe auch Tabelle 1). Die RAPD-PCR wurde in einem Thermocycler (T-Gradient von Eppendorf, Hamburg, BRD) durchgeführt: Start der PCR erfolgte nachdem der Deckel des Thermocyclers auf 105°C vorgeheizt worden war: 95°C für 5 min, 45 Zyklen mit: 36°C für 1 min; 72°C für 2 min; 95°C für 1 min und RAPD-Nachsynthese bei 36°C für 1 min; 72°C für 10 min und 20°C für 2 min.

Tabelle 1: Primerscreening mit 11 bzw. 171* Apfelsorten

Primer

Sequenz
(in 5'-3')- Richtung

Anzahl
monomorpher
Fragmente

Anzahl
polymorpher
Fragmente

TA (°C)

Fragmentlänge
(bp)

Pharmacia 01

G G T G C G G G A A

6

5

39

280-710

Pharmacia 02

G T T T C G C T C C

6

6

38

380-2500

Pharmacia 03

G T A G A C C C G T

8

4

33

300-1300

Pharmacia 04

A A G A G C C C G T

8

6

34

190-1350

Pharmacia 05

A A G G C G C A A C

10

3

34

250-1400

Pharmacia 06

C C C G T C A G C A

9

7

38

90-1600

Roth 170/06

G G A C T C C A C G

7

5

36

290-1500

Roth 170/09

T G C A G C A C C G

11

2

38

380-1300

Roth 170/10

C A G A C A C G G C

3

5

38

550-1410

P2 (Koller et al. 1993)

A C G A G G G A C T

5

5

38

490-1320

E6 (Koller et al. 1993)

A A G A C C C C T C

5

7

40

320-1500

UBC3 (gerlach 1998)

C C T G G G C T T A

6

7

32

330-2100

UBC5 (gerlach 1998)

C C T G G G T T C C

7

6

40

310-1300

B18 (Landry et al. 1994)

C C A C A G C A G T

6

7

38

490-2000

Roth 170/08*

C T G T A C C C C C

4

8

38

320-1300

A18* (Landry et al. 1994)

A G G T G A C C G T

1

10

32

470-1750

A17* (Landry et al. 1994)

G A C C G C T T G T

1

8

36

650-1500

Amplifizierte DNA-Fragmente wurden auf Agarosegelen in einer B2 Apparatur von Pequlab, (Erlangen, BRD) bei 8,5 V/cm aufgetrennt. Es wurde 1,5%ige Agarose (Sorte Genaxis TinyII, Genaxis, Heidelberg, BRD) verwendet. Als Fragmentgrößenstandard diente der 100 bp Marker von Pharmacia Biosciences. Nach dem Lauf wurden die Gele mit SYBR-Gold von MoBiTec (Göttingen, BRD) für 20 min gefärbt und unter UV-Licht dokumentiert. Die Datenanalyse erfolgte visuell. Als homologe Banden oder Fragmente wurden Banden bezeichnet, die bei allen mit dem gleichen Primer untersuchten Apfelsorten an der gleichen Stelle im Gel vorkamen. Fragmente, die bei mindestens einer Sorte beobachtet worden waren, wurden als polymorph bezeichnet und konnten als Marker für die Sortenidentifizierung eingesetzt werden. Kriterien für die Bewertung der Primer waren Grad an Hintergrundsignalen, Deutlichkeit und Ausprägung der Banden, Reproduzierbarkeit der Bandenmuster, sowie das Auftreten polymorpher Fragmente. Die Reproduzierbarkeit eines jeden Markers (= polymorphes Fragment) wurde durch mindestens zwei Versuchswiederholungen sichergestellt. Die Auswertung aller als Marker definierten RAPD-Fragmente führt zu einem für jede Sorte typischen Markerphänotyp. Jedes Fragment wird dabei als Allel eines Markerlokus mit den Ausprägungen 1 (vorhanden) und 0 (nicht vorhanden) aufgefasst. Bei Erfassung aller Markerloci ergibt sich ein für jede Sorte charakteristischer binärer Code.

Ergebnisse

DNA-Extraktion

Aus Gründen der guten Reproduzierbarkeit wurde das „Nucleon Extraction Kit" der Firma Amersham Biosciences zur DNA-Extraktion eingesetzt und das Extraktionsprotokoll für die Extraktion von DNA aus Apfelblättern modifiziert. Der modifizierte Einsatz dieses „Kits" führte zur Gewinnung reiner DNA. Die Reinheit dieser DNA wurde sowohl mittels Gelelektrophorese als auch im Spektrometer unter UV-Licht überprüft. Die Quantifizierung der DNA Ratio im Spektrophotometer erfolgt über das A260 : A280-Verhältnis. Das A260 : A280-Verhältnis gibt Auskunft über Proteinverunreinigungen und sollte unter 2 liegen (Manning 1991). Das A260/A280-Verhältnis der von uns isolierten DNA betrug zwischen 1,6 und 1,9. Dies lässt auf reine DNA ohne Verunreinigungen mit Proteinen schließen. Auf dem Agarosegel wies die DNA eine deutliche Bande auf und es waren keine Degradationsprodukte oder RNA-Verunreinigungen zu beobachten. Die Ausbeute an DNA betrug zwischen 2 und 150 µg DNA aus 20 mg Blattmaterial. Da für eine RAPD-Reaktion nur 30 ng DNA benötigt werden, reicht eine DNA-Extraktion für mindestens 70 RAPD-Reaktionen aus. Die neu etablierte Methode eignete sich nicht nur für die DNA-Extraktion von DNA aus Apfelblättern sondern auch für die DNA-Extraktion aus Blättern von Birne, Pfirsich, Kirsche oder Zwetsche. Da im Gegensatz zu den meisten herkömmlichen Extraktionsmethoden kein Phenol mehr benötigt wird, gibt es keine Probleme bei der Phenolentsorgung als Sondermüll.

Primerscreening mit 11 Apfelsorten

Für das Vorscreening nach geeigneten Primersequenzen, die für die jeweilige Apfelsorte sortentypische Marker liefern, wurden folgende Apfelsorten verwendet: ‘Cox Orange’ ‘Clivia’, ‘Klarapfel’, ‘Roter Boskoop’ und „Glockenapfel’ sowie die ‘Delicious’-Kreuzungen ‘Jonagold Ba/Wü’, ‘Rebella’, ‘Remo’, ‘Rubinette’, ‘Golden Delicious’ und ‘Pinova’. Mit einem Gradiententhermocycler wurde die optimale Annealing-Temperatur der Primer (=Temperatur bei der die Primer an die DNA binden) ermittelt die zwischen 32°C und 40°C lag (s. Tabelle 1). Dies diente dazu, DNA-Fingerabdrücke mit möglichst scharfen Fragmentmustern zu erhalten. Teilweise wurden Primer verwendet, die sich schon bei der Identifikation anderer Apfelsorten bzw. Unterlagen bewährt hatten (Gerlach 1998, Landry et al. 1994, Koller et al. 1993). Von 26 getesteten Primersequenzen führten zwei zu keiner Amplifikation. Sieben Primer wurden aufgrund undeutlicher Bandenmuster verworfen. Die siebzehn Primersequenzen, die deutliche Bandenmuster aufwiesen, erzeugten insgesamt 104 polymorphe und 103 monomorphe Fragmente mit Fragmentlängen von 280 bp bis 2000 bp (Tabelle 1). Ihre optimale Annealing-Temperatur betrug zwischen 32°C und 40°C. Fünf Primer ergaben Bandenmuster mit wenigen sortentypischen Markern und zwölf Primer führten zu einer guten Differenzierung der untersuchten Apfelsorten. Die Verwendung der Primer Pharmacia 03, UBC3, B18, A18, A17 und Roth 170/08 führte zu Bandenmustern mit scharfen Banden und geringem Hintergrund. Pro Primer wurden zwischen zwei und zehn polymorphen Fragmenten beobachtet. Da die Primer A17, A18 und Roth 170/08 bereits im Vorscreening die meisten polymorphen Fragmente (8 bzw. 10) aufwiesen, wurden sie zur Untersuchung der weiteren 171 Apfelsorten und Mutanten eingesetzt.

DNA-Fingerprints für 140 Apfelsorten bzw. Mutanten

Für jedes Apfelisolat wurden drei verschiedene Fingerprints mit den Primern A17, A18 und Roth 170/08 erstellt (Tabelle 2). Es wurden insgesamt 34 RAPD-Loci mit Fragmentlängen von 320 bp bis 1750 bp ermittelt. 26 RAPD-Loci (76,5%) wiesen Polymorphismen auf und konnten als Marker für die Sortenidentifizierung verwendet werden. Je nach Sorte bzw. Mutante wurden zwischen sieben und fünfzehn RAPD-Marker (= polymorphe Fragmente) ermittelt. Die Frequenz der einzelnen Marker ist in Tabelle 2 aufgeführt. Die Kombination dieser insgesamt 26 RAPD-Marker reichte für die Identifizierung von 135 Apfelsorten und den Mutanten ‘Cox Orange Queen’, ‘Holsteiner Cox Esselborn’, ‘Gala Galaxy’, ‘Delbarestivale Ambassy’ und ‘Jonagold BaWü’ aus (Tabelle 3). Alle anderen untersuchten Mutanten wiesen jeweils nur ein sortentypisches, nicht aber ein mutantentypisches Bandenmuster auf. Alle untersuchten Apfelsorten und ihre Herkunft sind in Tabelle 3 aufgelistet. Eine Tabelle mit den binären Codes der 140 Apfelsorten und Mutanten kann bei der Verfasserin dieser Arbeit angefordert werden.

Tabelle 2: Markerbanden bei 171 getesteten Apfelsorten und Mutanten

Primer
(monomorphe Banden)

monomorphe
Bande (bp)

Markerbande 
(bp)

absolute
Häufigkeit
Markerbande

relative
Häufigkeit
Markerbande

Roth 170/08

320

370

127

0,74

560

410

56

0,33

780

430

18

0,10

1150

530

15

0,087

 

680

166

0,97

 

750

154

0,90

 

1280

82

0,42

 

1300

80

0,47

Roth A18

620

470

9

0,05

 

600

15

0,09

 

800

14

0,08

 

950

42

0,25

 

1000

3

0,02

 

1030

44

0,25

 

1080

150

0,87

 

1350

28

0,16

 

1400

28

0,16

 

1750

163

0,95

Roth A17

1300

650

56

0,33

 

750

141

0,82

 

800

78

0,46

 

890

83

0,48

 

900

20

0,12

 

960

16

0,09

 

990

143

0,84

 

1500

38

0,22

Diskussion

Eine Vorbedingung für die RAPD-PCR-Methode stellt die einfache Gewinnung möglichst wenig verunreinigter DNA dar. Die DNA-Extraktion aus pflanzlichem Material ist oftmals problematisch, weil Polysaccharide und phenolische Substanzen einen Komplex mit den Nucleinsäuren bilden. Diese Verunreinigungen können die Aktivität von DNA-modifizierenden Enzymen hemmen. Zur Reinigung und zum Schutz vor diesen Verunreinigungen werden deshalb oftmals ß-Mercaptoethanol und/oder Polyvinylpyrrolidone (PVP-40T) zur Verhinderung der Polyphenoloxidation verwendet (Green und Thompson 1999; Guillemaut 1992). Als Methode zur DNA-Extraktion aus Apfelblättern (siehe auch Abb. 1) wurden bislang meist Modifikationen des Extraktionsprotokolls von Dellaporta et al. 1983 verwendet (Koller et al. 1993 und Morton et al. 1993). Ein Nachteil dieser Methoden ist die Verwendung größerer Mengen von Chloroform und oft auch Phenol; beide Substanzen sind gesundheitsschädlich und müssen kostspielig entsorgt werden. Ein weiterer Nachteil der oben genannten Methoden besteht darin, dass das Blattmaterial unter dem kostspieligen Einsatz von flüssigem Stickstoff aufgearbeitet wird. In dieser Arbeit wurden die Apfelblätter mittels Gefriertrocknung konserviert und für die DNA-Extraktion vorbereitet. Dadurch konnte der Einsatz des teuren flüssigen Stickstoffs vermieden werden. Des weiteren kam unsere Extraktionsmethode ohne den Einsatz von Phenol aus.

Einen bekannten Nachteil der RAPD/PCR-Methode stellte bisher die oftmals schlechte Reproduzierbarkeit der Bandenmuster da. Dies könnte an unterschiedlichen Versuchsbedingungen und Reaktionsmedien begründet gewesen sein, da die Bandenmuster unter den vorgegebenen experimentellen Gegebenheiten immer reproduzierbar waren (Warburton und Bliss 1996). In dieser Arbeit wurde die Reproduzierbarkeit deshalb durch die Verwendung standardisierter Extraktions- und PCR-Reaktionskits erhöht. Zudem stellten Landry et al. (1994) fest, dass das Dendrogram von 25 Unterlagssorten bei Apfel, das mittels RAPD/PCR erstellt worden war, perfekt mit den tatsächlichen Verwandtschaftsbeziehungen der Unterlagen übereinstimmte.

Diese Arbeit zeigt, dass sich die RAPD/PCR-Methode gegebenenfalls sogar zur Identifizierung von Mutanten wie ‘Delbarestivale Ambassy’ oder ‘Gala Galaxy’ eignet, was bislang noch nicht einmal mit der Mikrosatellitenmethode erreicht worden ist (Guilford et al. 1997; Hokanson et al. 1998). Zudem ist bei der RAPD/PCR-Methode die Ausbeute an Banden normalerweise höher als bei der Verwendung von Mikrosatelliten (Milbourne et al. 1997). Die eindeutige Identifizierung von 140 Apfelsorten und Mutanten zeigt, dass die RAPD/PCR-Methode ein ideales Marker-System zur Identifizierung von Apfelsorten darstellen kann.

Die Untersuchungen wurden mit Unterstützung des Ministeriums Ländlicher Raum Baden-Württemberg (Förderkennzeichen: 24 - 8251. 02 / 02 11 E) und des Landes Bayern durchgeführt.

Literatur

Bell, R. L.; Cain, S. (1998): Use of RAPD fingerprints for verification of synonyms and studies of genetic distance in pear genetic resources. HortScience 33(3), 492

Dellaporta, S. L.; Wood, J.; Hicks, J. B. (1983): A plant DNA Minipreparation: Version II. Plant Mol. Biol. Rep. 1, 19-21.

Gerlach H. K.; Stösser R. (1997): Patterns of Random Amplified Polymorphic DNAs for Sweet Cherry (Prunus avium L.) Cultivar Identification. Angew. Bot. 71, 212-218.

Gerlach, H. (1998): Sortenidentifizierung bei Süßkirsche (Prunus avium L.), Apfel (Malus x domestica Borkh.) und Birne (Pyrus communis L.) über die in vitro-Amplifizierung von DNA (DNA-Fingerprinting). Dissertation 1998, Verlag Ulrich Grauer Stuttgart.

Green, M. J.; Thompson, D. A. (1999): Easy and efficient DNA-extraction from woody plants for the detection of phytoplasmas by polymerase chain reaction. Plant Dis. 83, 482-485.

Guilford, P.; Prakash, S., Zhu, J. M.; Rikkerink, E.; Gardiner, S.; Bassett, H.; Forster, R. (1997): Microsatellites in Malus X domestica (apple): abundance, polymorphism and cultivar identification. Theor. Appl. Genet. 94, 249-254.

Guillemaut, P.; Maréchal-Drouard, L. (1992): Isolation of Plant DNA: A fast inexpensive and reliable method. Plant Mol. Biol. Reporter 10 (1), 60-65.

Hokanson, S. C.; Szewc-McFadden, A. K.; Lamboy, W. F.; McFerson J. R. (1998): Microsatellite (SSR) markers reveal genetic identities, genetic diversity and relationships in a MalusXdomestica borkh. Core subset collection. Theor. Appl. Genet. 97, 671-683.

Koller, B.; Lehmann, J. M.; McDermott, J. M.; Gessler, C. (1993): Identification of apple cultivars using RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 85, 901-904.

Landry, B. S.; Li, R. Q.; Cheung, W. Y.; Granger, R. L. (1994): Phylogeny analysis of 25 apple rootstocks using RAPD markers and tactical gene tagging. Theor. Appl. Genet. 89, 847-852.

Manning, K. (1991): Isolation of nucleic acids from plants by differential solvent precipitation. Anal. Biochem. 195, 45-50.

Milbourne, D.; Meyer, R.; Bradshaw, J. E.; Baurd, E.; Bonar, N.; Provan, J.; Powell, W.; Waugh, R. (1997): Comparison of PCR-based marker systems for the analysis of genetic relationships in cultivated potato. Molecular Breeding 3, 127-136.

Morton A.; Adams, A. N.; Barbara, D.J. (1993): Rapid PCR-based identification of apple (malus) cultivars and species. BCPC Monograph 54: Plant Health and the European Single Market, 289-294.

Nybom, H.; Gardiner, S.; Simon, C. J. (1992): RFLPs obtained from an rDNA probe and detected with enhanced chemiluminescence in apples. HortScience 27, 355-356.

Oliveira, C.M.; Mota, M.; Monte-Corvo, L.; Goulao, L.; Silva, D. M. (1999): Molecular typing of Pyrus based on RAPD-markers. Scientia Horticulturae 79, 163-174.

Tancred, S. J.; Zeppa, A. G.; Graham, G. C. (1994): The use of the PCR-RAPD technique in improving the plant variety rights description of a new Queensland apple (Malus domestica) cultivar. Australian Journal of Experimental Agriculture 34, 665-667.

Warburton, M. L.; Bliss, F. A. (1996): Genetic diversity in peach (Prunus persica L. Batch) revealed by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers and compared to inbreeding coefficients. Amer. Soc. Hort. Sci. 121(6), 1012-1019.

Williams, J. K. G.; Kubelik, A. R., Livak, K. J.; Rafalski, J. A.; Tingey, S. V. (1990): DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl. Acids. Res. 18, 6531-6535.

Zyprian, E. (1998): Plant breeding: Genetic mapping in woody crops. Progress in Botany 60, 167-189.

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