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RAPD-Marker bei Malus x domestica (Apfel) und Pyrus communis (Birne) als Mittel zur Sortenidentifizierung - Teil II: Pyrus communis (Birne)

Use of RAPD-Markers in Malus x domestica (apple) and Pyrus communis (pear) for cultivar identification - Part II: Pyrus communis (pear)

M. Stark-Urnau, Weinsberg

 

Zusammenfassung

Der Sortennachweis bei Birnen kann durch Verwendung von RAPD-Markern bereits mit Hilfe einzelner Blattproben erfolgen, indem die DNA-Fingerabdrücke bereits identifizierter Sorten mit den Fingerabdrücken unbekannter Proben verglichen werden. Unter Verwendung von drei Primern wurden 44 Birnensorten molekulargenetisch charakterisiert. Es wurden insgesamt 28 RAPD-Loci mit Fragmentlängen von 550 bp bis 2000 bp ermittelt. 21 RAPD-Loci (75 %) wiesen Polymorphismen auf und konnten als Marker für die Sortenidentifizierung verwendet werden. Für 29 der 44 Genotypen war es möglich mindestens einen Primer zu finden, der einen sortentypischen Fingerabdruck lieferte. Die Kombination aller 21 RAPD-Marker reichte für die Identifizierung von 44 Birnensorten aus. Je nach Sorte bzw. Mutante wurden zwischen fünf und vierzehn RAPD-Marker (= polymorphe Fragmente) ermittelt. Die untersuchten Mutanten ‘Conference’ und ‘Conference 202’ sowie die ‘Williams Christ-Mutanten’ wiesen jeweils nur ein sortentypisches, nicht aber ein mutantentypisches Bandenmuster auf.

Summary

Distinguishing between different pear varieties can be performed by comparing DNA-fingerprints of already identified cultivars with DNA-fingerprints of unknown cultivars. Three primers were selected for molecular characterization of 44 pear varieties. The three primers produced a total of 28 fragments. The fragment lengths ranged from 550-2000 basepaires (bp). 21 RAPD loci (75%) exhibited polymorphisms and the fragments amplified from that loci were defined as markers suitable for cultivar-identification. For 29 of the 44 genotypes analysed it was possible to find at least one primer which produced cultivar-specific fragment patterns. The combination of 21 the polymorphic RAPD-markers found was sufficient to identify 44 pear cultivars. Depending on the cultivar five to fourteen polymorphic fragments were found. The sports ‘Conference’ and ‘Conference 202’ as well as the ‘Barlett’ sports exhibited cultivar-specific but not sport-specific fragement patterns.

Keywords

RAPD-PCR, DNA-Fingerprinting, pear cultivars, pear, cultivar identification

Einleitung

Bei der Obstproduktion in gemäßigten Klimaten steht die Birne nach Trauben und Apfel an dritter Stelle. Vergleichbar zum Apfel wurde die Birne wohl schon nach der Eiszeit im Zuge der Wanderungen damaliger Völkerschaften in den Balkan, sowie nach Mittel- und Westeuropa gebracht. Die genetischen Vorläufer unserer europäischen Kultursorten scheinen aus dem Kaukasus und aus Kleinasien zu stammen. Ausgangsform für die ausschließlich in Europa entstandenen Kultursorten ist Pyrus communis, die Kulturbirne. Sie soll unter hauptsächlicher Beteiligung von P pyraster und P. nivalis aus vielzähligen Hybridisierungen entstanden sein, (Silbereisen et al.1996). Die Gattung Birne umfasst insgesamt 20 bis 30 Arten, von denen P. communis (europäische Birne) und P pyrifolia (Burm.) Nakai (Pyrus serotina Rehder) (asiatische Birne oder Nashi-Birne) die wirtschaftlich bedeutendsten Arten darstellen (Oliveira et al. 1999). Beide Arten sind diploid (2x = 34) und selbst-unfruchtbar.

Bei der gegenwärtigen großen Vielfalt an Birnensorten, die durch vegetative Vermehrung produziert werden, stellt die zuverlässige und schnelle Sortenbestimmung eine Notwendigkeit für die Baumschulen und Züchter dar. Eine genaue Sortenidentifikation mittels definierter Marker ist auch beim Sortenschutz von Sorten erforderlich. Früher wurde die Sortenbestimmung bei Birnen anhand morphologischer oder physiologischer Merkmale durchgeführt. Ebenso wurden biochemische Marker in Form von Isoenzymen zur Sortenidentifizierung eingesetzt (Chung und Ko 1995). Diese Marker deckten jedoch nicht ausreichend Polymorphismen zwischen verwandten Genotypen auf oder es ergaben sich Unregelmäßigkeiten bei den Markern in Abhängigkeit vom physiologischen Alter der Probe. Mittlerweile hat sich die RAPD-Methode bei Birnen als Methode der Wahl herausgestellt (Oliveira et al. 1999), da sie nur geringe Mengen an DNA benötigt, leicht einsetzbar ist und weder Blotting-Schritte noch radioaktive Nachweismethoden erfordert. Ein Sortenscreening an Birnen mit der RAPD-PCR-Methode wurde bereits an 20 Birnensorten von P. communis durchgeführt (Gerlach 1998) und an 12 Genotypen aus vier Arten der Gattung Birne (P. communis, P. pyrifolia, P. cordata und P. bourgiaeana (Oliveira et al. 1999).

Ziel der Arbeit war es, parallel zur phänologischen Bestimmung einer Birnensorte entsprechende sortentypische RAPD-Marker festzulegen. Zur Erleichterung künftiger Sortenidentifizierungen sollte der persönliche genetische Fingerabdruck von 44 Birnensorten und Mutanten bestimmt werden, um in Zukunft einerseits die Sortenechtheit und Reinheit des Pflanzmaterials aus Reiserschnittgärten überprüfen zu können und andererseits auch Sortenbestimmungen für private Interessenten zu ermöglichen.

Material und Methoden

Pflanzenmaterial: Junge frisch entfaltete Blätter von insgesamt 44 Birnensorten oder Mutanten wurden in den Monaten Juni bis August gesammelt, gefriergetrocknet und bei -20°C gelagert. 44 Birnensorten oder Mutanten stammten von phänologisch eindeutig charakterisierten Bäumen aus Baden-Württemberg (Standorte Augustenberg und Heuchlingen) und entsprechen dem Sortenspiegel des im Versuchsstandort Heuchlingen der Staatlichen Lehr- und Versuchsanstalt für Wein und Obstbau Weinsberg aufgepflanzten Sortenkontrollgartens.

DNA-Extraktion und RAPD-Analyse erfolgten wie in Teil I beschrieben. Einzige Modifikation war der Einsatz von 90 ng DNA / RAPD-Reaktion. Die Primer wurden von Roth (Karlsruhe, BRD) synthetisiert (siehe auch Tabelle 1).

Tabelle 1: Primerscreening mit 10* bzw. 44 Birnensorten:

Primer

Sequenz(in 5'-3')-Richtung

Anzahl monomorpher Fragmente

Anzahl polymorpher Fragmente

TA (°C)

Fragmentlänge (bp)

UBC 178

CCG TCA TTG G

2

8

21

580-2000

UBC 189

TGC TAG CCT C

2

7

38

550-1500

UBC 192

GCA AGT CAC T

3

6

24

750-1400

UBC 181

ATG ACG ACG G

8

0

24

470-980

UBC 184

CAA ACG GCA C

7

2

36

480-550

UBC 186

GTG CGT CGC T

3

5

38

560-2200

Gelelektrophorese und Auswertung erfolgte wie in Teil I beschrieben.

Ergebnisse

Primerscreening mit 10 Birnensorten

Für das Vorscreening nach geeigneten Primersequenzen, die für die jeweilige Birnensorte sortentypische Marker liefern, wurden folgende elf Birnensorten verwendet: ‘Vereinsdechants’, ‘Williams Christ Rotholz’, ‘Williams Christ Grünholz’, ‘Clapps Liebling’, ‘Conference’, ‘Conference 202’, ‘Alexander Lukas’, ‘Concorde’, ‘Amanlis Butterbirne’, ‘Bristol Cross’ und ‘Pierre Corneille’. Alle 6 Primer lieferten klare und deutliche Bandenmuster. Als optimale Primer erwiesen sich die Primer UBC 178, UBC 189 und UBC 192, weil sie zwischen sechs und acht polymorphe, deutlich differenzierbare Fragmente lieferten, das heißt Banden, die bei einigen Birnensorten ausgebildet werden, und bei anderen nicht (siehe Tabelle 1). Sie wurden deshalb zur molekulargenetischen Charakterisierung aller 44 Birnensorten eingesetzt. Der Einsatz von Primer UBC 181 zeigte zwar deutliche Bandenmuster, die aber bei den im Vorscreening eingesetzten Birnensorten zu keiner Differenzierung führten, weil die Banden monomorph waren. Ebenso führte der Einsatz von den Primern UBC 184 und UBC 186 nur zu einer geringen Anzahl polymorpher Fragmente (siehe Tabelle 1).

Zusätzlich wurde mit einem Gradiententhermocycler die optimale Annealing-Temperatur der Primer (= Temperatur bei der die Primer an die DNA binden) ermittelt, die zwischen 21 °C und 38 °C lag (siehe Tabelle 1). Bei optimalen Annealing-Temperaturen ergaben sich sowohl deutlich differenzierbare als auch reproduzierbare Bandenmuster. Als Beispiele für RAPD-Bandenmuster mit den Primern UBC 192, UBC 189 und UBC 178 sind Bandenmuster mit den jeweils gleichen Birnensorten in den Abbildungen 1 bis 3 dargestellt. Bei Primer UBC 178 konnte gezeigt werden, dass 10 ng DNA für eine RAPD-Reaktion zu wenig sind und erst ab 60 ng DNA / RAPD-Reaktion ein deutliches Bandenmuster erzielt wird. Weiter konnte nachgewiesen werden, dass zwischen 60 ng und 120 ng DNA / RAPD-Reaktion identische Bandenmuster erzeugt werden (Abb. 4). Als optimale DNA-Konzentration für Birne erwiesen sich 90 ng DNA / RAPD-Reaktion. Die Wiederholung der RAPD-Reaktion mit Primer UBC 192 und DNA von „Gellerts Butterbirne" aus zwei verschiedenen DNA-Extraktionen führte zu identischen Bandenmustern. Dies zeigt, dass die Methode einerseits reproduzierbar ist, und andererseits, dass Abweichungen von der optimalen DNA-Konzentration von bis zu 50% nicht zu unerwünschten Veränderungen des Bandenmusters führen.

Abb.1: RAPD-Bandenmuster mit Primer UBC 192. Nr. 1 = Gute Luise; Nr. 2 = Packhams Triumph; Nr. 3 = Köstliche von Charneux; Nr. 4 = Tongern; Nr. 5 = Williams Christ Rot; Nr. 6 = Schweizer Wasserbirne; Nr. 7 = Trevoux Birne; Nr. 8 = Gellerts Butterbirne; Nr. 9 = Pastorenbirne; Nr. 10 = Grafin von Paris; Nr. 11 = Nordhäuser Winterforelle

 

Abb.2: RAPD-Bandenmuster mit Primer UBC 189. Nr. 1 = Gute Luise; Nr. 2 = Packhams Triumph; Nr. 3 = Köstliche von Charneux; Nr. 4 = Tongern; Nr. 5 = Williams Christ Rot; Nr. 6 = Schweizer Wasserbirne; Nr. 7 = Trevoux Birne; Nr. 8 = Gellerts Butterbirne; Nr. 9 = Pastorenbirne; Nr. 10 = Grafin von Paris; Nr. 11 = Nordhäuser Winterforelle

 

 

Abb.3: RAPD-Bandenmuster mit Primer UBC 178. Nr. 1 = Gute Luise; Nr. 2 = Packhams Triumph; Nr. 3 = Köstliche von Charneux; Nr. 4 = Tongern; Nr. 5 = Williams Christ Rot; Nr. 6 = Schweizer Wasserbirne; Nr. 7 = Trevoux Birne; Nr. 8 = Gellerts Butterbirne; Nr. 9 = Pastorenbirne; Nr. 10 = Grafin von Paris; Nr. 11 = Nordhäuser Winterforelle

 

Abb.4: RAPD-Bandenmuster mit Primer UBC 178 und „Gellerts Butterbirne" (Nr. 1-3); und mit Primer UBC 192 und „Amanlis Butterbirne" (Nr. 4-7). Es wurden unterschiedliche DNA-Konzentrationen eingesetzt: Nr.1: 10 ng, Nr.2: 30 ng; Nr. 3: 60 ng; Nr. 4: 60 ng; Nr. 5: 120 ng; Nr. 6: 60 ng und Nr. 7: 120 ng.

 

DNA-Fingerprints für 44 Birnensorten

Für jedes Birnenisolat wurden je drei verschiedene Fingerprints mit den Primern UBC 178, UBC 189 und UBC 192 erstellt (siehe Tabelle 2). Es wurden insgesamt 28 RAPD-Loci mit Fragmentlängen von 550 bp bis 2000 bp ermittelt. 21 RAPD-Loci (75 %) wiesen Polymorphismen auf und konnten als Marker für die Sortenidentifizierung verwendet werden. Die relative Häufigkeit der einzelnen Marker ist in Tabelle 2 aufgeführt und reicht von 0 bis 0,9. Für 29 der 44 Genotypen war es möglich mindestens einen Primer zu finden, der einen sortentypischen Fingerabdruck lieferte. Die Kombination aller 21 RAPD-Marker reichte für die Identifizierung von 44 Birnensorten aus (siehe Tabelle 3). Je nach Sorte bzw. Mutante wurden zwischen fünf und vierzehn RAPD-Marker (= polymorphe Fragmente) ermittelt. Die untersuchten Mutanten ‘Conference’ und ‘Conference 202’ sowie die ‘Williams Christ-Mutanten’ wiesen jedoch jeweils nur ein sortentypisches, nicht aber ein mutantentypisches Bandenmuster auf.

Tabelle 2: Markerbanden bei 44 getesteten Birnensorten und Mutanten

Primer

monomorphe Bande (bp)

Bandenmuster bei 44 Birnensorten

Markerbande (bp)

absolute Häufigkeit (Markerbande)

relative Häufigkeit (Markerbande)

 UBC 192

 750

 16

 830

 24

 0,5

 

 800

 

 890

 38

 0,9

 

 950

 

 1050

39

 0,9

 

1400

 

1150

30

0,7

 

 

 

1300

40

0,9

 

 

 

1800

12

0,3

UBC 189

550

16

800

41

0,9

 

750

 

880

32

0,7

 

 

 

930

6

0,1

 

 

 

1000

2

0,0

 

 

 

1090

38

0,9

 

 

 

1300

2

0,0

 

 

 

1500

8

0,2

UBC 178

890

21

580

26

0,6

 

2000

 

720

16

0,4

 

 

 

730

4

0,1

 

 

 

850

23

0,5

 

 

 

920

16

0,4

 

 

 

1150

1

0,0

 

 

 

1350

36

0,8

 

 

 

1400

7

0,2

 

Tabelle 3: Binärer Code von 44 Sorten bei Anwendung von 21 Sortenmarkern

  Birnensort

Primer UBC 192

Primer UBC 189

Primer UBC 178

Anzahl
Mark

   Markerbanden (bp)

Markerbanden (bp)

 Markerbanden (bp) 

830

890

950

1050

1130

1300

800

880

930

1000

1090

1300

1500

580

720

730

850

950

1150

1350

1400

Alexander-Lukas

1

1

1

1

1

0

1

0

1

0

1

0

0

0

0

0

1

1

0

1

0

11

Amanlis Butterbirne

0

1

1

1

1

0

1

1

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

0

1

0

8

Bayrische Weinbirne

1

1

1

1

1

0

1

1

0

0

1

0

0

0

0

0

1

0

0

1

0

10

Benita

1

1

1

1

1

0

1

1

0

1

1

0

1

1

0

0

0

1

0

1

0

13

Boscoops Flaschenbirne

0

1

1

0

1

0

1

0

0

0

0

0

0

1

0

0

0

1

0

1

0

7

Bristol Cross

0

0

1

0

1

1

1

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

9

Bunte Juli

1

1

1

1

1

0

1

0

0

0

1

0

0

1

1

0

1

0

0

1

0

11

Champagner Bratbirne

0

1

1

0

1

0

1

1

0

0

1

1

1

1

0

0

1

0

0

1

0

11

Clairgeaux Butterbirne

1

1

1

0

1

0

0

1

1

0

1

0

0

1

1

0

1

1

0

1

0

12

Clapps-Liebling

1

1

1

1

1

0

1

0

0

0

1

0

0

1

0

1

0

0

0

0

0

9

Concorde

0

0

1

1

0

0

1

1

0

0

1

0

0

1

0

0

0

0

0

1

0

7

Condo

0

1

1

0

1

0

1

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

9

Conference

0

1

1

0

1

0

1

1

0

0

1

0

0

1

0

0

0

1

0

1

0

9

Conference 202

0

1

1

0

1

0

1

1

0

0

1

0

0

1

0

0

0

1

0

1

0

9

echte Knausbirne

0

1

1

1

1

0

1

0

0

0

1

0

0

0

1

0

0

0

0

1

0

8

Gellerts Butterbirne

1

1

1

1

1

0

1

1

0

0

1

0

0

0

1

0

1

1

0

1

0

12

George Boucher

1

1

1

1

0

1

1

1

0

0

1

0

0

0

0

0

0

1

0

1

0

10

Gräfin von Paris

1

1

1

0

1

0

1

1

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

6

Gute Graue

0

1

1

1

1

0

1

0

0

0

1

0

1

1

1

0

0

0

0

1

1

11

Gute Luise

0

1

1

1

1

0

1

0

0

0

1

0

0

0

0

0

1

0

0

1

1

9

Harrow Delight

0

0

1

1

1

1

1

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

10

Herzogin Elsa

1

1

1

1

1

0

1

0

0

0

0

0

1

1

0

1

0

0

0

1

1

11

Köstliche von Charneux

1

0

1

1

1

0

1

1

0

0

1

0

0

1

1

0

1

1

0

1

1

13

Kirchensaller Mostbirne

1

1

0

0

1

1

1

1

1

0

0

0

1

0

0

0

1

0

0

0

0

9

Madame verte

1

1

1

0

0

1

1

1

0

0

1

0

0

1

1

0

1

0

0

1

0

11

Metzer Bratbirne

0

0

0

1

0

0

1

0

0

0

1

0

0

0

1

0

0

0

0

1

0

5

Nägelesbirne

0

1

1

0

1

0

1

1

0

1

1

0

0

1

1

0

0

0

0

0

0

9

Nordhäuser Winterforelle

1

1

0

1

1

1

1

1

1

0

1

0

0

0

0

1

0

0

0

1

0

11

Packhams Triumph

0

1

1

1

1

1

0

1

1

0

1

0

0

0

0

0

1

1

0

0

0

10

Passa Crassane

1

1

1

1

1

´1

1

1

0

0

1

0

0

0

0

0

0

0

0

1

0

9

Pastorenbirne

1

1

1

1

1

0

1

1

0

0

1

0

0

0

1

0

0

1

0

1

0

11

Pierre Corneille

1

1

1

1

1

0

1

1

1

0

1

0

0

1

1

0

0

1

0

0

0

12

Schweizer Wasserbirne

1

1

1

1

1

0

1

0

0

0

1

1

1

0

1

0

0

1

1

1

1

14

Starkcrimson

1

1

1

1

1

0

1

0

0

0

1

0

0

1

1

0

0

0

0

0

0

9

Suttgarter Gaishirtle

0

1

0

0

1

0

1

1

0

0

1

0

1

0

0

0

1

0

0

1

0

8

Tongern

1

1

1

0

1

0

0

1

0

0

1

0

1

1

0

0

1

1

0

1

1

12

Trevoux Birne

0

0

1

1

1

1

1

0

0

0

1

0

0

1

0

1

1

0

0

1

0

10

Triumph von Vienne

0

1

1

1

1

1

1

1

0

0

1

0

0

0

0

0

1

0

0

1

0

10

Vereinsdechants

1

1

1

1

1

0

1

1

0

0

1

0

0

1

0

0

0

1

0

1

1

12

Wahlsche Schnapsbirne

0

1

0

0

1

0

1

1

0

0

1

0

0

0

1

0

1

1

0

0

0

8

Wilde Eierbirne

0

1

1

1

1

0

1

1

0

0

0

0

0

1

1

0

1

0

0

1

0

10

Williams Christ-Grünholz

1

1

1

1

1

1

1

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

12

Williams Christ-Rotholz

1

1

1

1

1

1

1

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

0

1

0

12

Williams Christ Rot

1

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Diskussion

Die Birne hat vergleichbar der Kulturform des Apfels eine breite genetische Basis (Bell et al. 1996). In dieser Arbeit wiesen die RAPD-Bandenmuster einen hohen Grad an Polymorphismen bei Birnensorten auf, was einen nützlichen Beitrag zum Sortennachweis bei dieser Gattung leistet. Dennoch sollte man die Nachteile und Grenzen dieser Methode nicht vergessen, wenn man die Ergebnisse betrachtet. So wird in erster Linie bei der RAPD-Methode die mangelnde Reproduzierbarkeit der Methode kritisiert. In dieser Arbeit waren die für die Bewertung ausgewählten polymorphen Fragmente jedoch bei allen Wiederholungen reproduzierbar. Zudem wurden 12 der von uns getesteten Birnensorten bereits von Gerlach (1998) mit den gleichen Primern untersucht. Trotz unterschiedlicher DNA-Extraktionsmethode und anderem Thermocycler bzw. PCR-Equipment waren die meisten ausgewählten Markerbanden identisch mit den in dieser Arbeit nachgewiesenen Banden. So wurden zum Beispiel bei Primer UBC 178 ebenfalls polymorphe Markerbanden bei 580 bp, 720 bp und 920 bp gefunden. Geringfügige Abweichungen bei den definierten Markerbanden können auf das unterschiedliche Sortenspektrum zurückgeführt werden: In unserer Arbeit wurden 44 Sorten aus dem Sortenkontrollgarten Heuchlingen untersucht und nur 12 Sorten sind identisch mit denen von Gerlach (1998).

Um die Reproduzierbarkeit der RAPD-Methode zu gewährleisten muss die DNA-Konzentration mit Sorgfalt ausgewählt werden, da zuviel DNA zu verschmierten Bandenmustern führen kann, während zu wenig DNA zu unreproduzierbaren Ergebnissen führt. Die von uns ausgewählte DNA-Konzentration von 90 ng / RAPD-Reaktion führte zu reproduzierbaren Ergebnissen.

Es konnte gezeigt werden, dass unter optimierten Bedingungen (DNA-Konzentration und Primerkonzentration und Annealingtemperatur) mit den Primern UBC 178, UBC 189 und UBC 192 alle Birnensorten differenziert werden außer den Mutanten von ‘Williams Christ’ und ‘Conference’, die nur ein sortentypisches, nicht aber ein mutantentypisches Fragmentmuster aufwiesen.

Die Untersuchungen wurden mit Unterstützung des Ministeriums Ländlicher Raum Baden-Württemberg (Förderkennzeichen: 24 - 8251. 02 / 02 11 E) und des Landes Bayern durchgeführt.

Literatur

Bell, R. L.; Cain, S. (1998): Use of RAPD fingerprints for verification of synonyms and studies of genetic distance in pear genetic resources. HortScience 33(3), 492

Chung, K.; Ko, K. (1995): Classification of native and cultivated Pyrus species in Korea by isozyme band patterns. J. Korean Soc. Hortic. Sci. 36, 829-835.

Gerlach, H. (1998): Sortenidentifizierung bei Süßkirsche (Prunus avium L.), Apfel (Malus x domestica Borkh.) und Birne (Pyrus communis L.) über die in vitro-Amplifizierung von DNA (DNA-Fingerprinting). Dissertation 1998, Verlag Ulrich Grauer Stuttgart.

Oliveira, C.M.; Mota, M.; Monte-Corvo, L.; Goulao, L.; Silva, D. M. (1999): Molecular typing of Pyrus based on RAPD-markers. Scientia Horticulturae 79, 163-174.

Silbereisen, R.; Götz, G.; Hartmann, W. (1996): Obstsorten Atlas. Verlag Eugen Ulmer Stuttgart, Seite 180-185.

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