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Untersuchungen zur Dauerhaftigkeit der Resistenz neuer Rebsorten

Dr. Walter K. Kast
LVWO Weinsberg
E-Mail:
walter.kast@lvwo.bwl.de

 

Ziele des Projektes

Abschätzung des Risikos, dass durch Anpassung der Zusammensetzung der Population pilzlicher Schaderreger (Uncinula necator und Plasmopara viticola) die Resistenz neuer Rebsorten durchbrochen werden kann d.h. dass ursprünglich resistente Sorten wieder anfällig werden könnten.
Sammeln und identifizieren von Pilzstämmen mit spezifischer Adaptation an resistente Rebsorten.

1. Uncinula necator (Echter Rebenmehltau, Oidium)
1.1 Entwicklung von Methoden zur Kultivierung von Oidium-Isolaten
1.2 Sammeln von Isolaten
2. Plasmopara viticola - (Rebenperonospora)
2.1 Sammeln von Isolaten, Vermehrung und Konservierung
2.2 Untersuchungen zur Virulenz von Plasmopara-Isolaten
2.3 Untersuchungen zur genetischen Variabilität von Peronospora
2.4 Untersuchungen zur Heterokaryose bei Peronospora
3. Abschätzung des Risikos des Durchbrechens der Resistenz
4. Nutzung der Isolate

 

Uncinula necator (Echter Rebenmehltau, Oidium)

Entwicklung von Methoden zur dauerhaften Kultivierung von Oidium-Isolaten

Das Ziel der folgenden Arbeit war es, eine Methode zur dauerhaften Kultivierung und Vermehrung des echten Rebenmehltaupilzes (Oidium) zu entwickeln. Oidium kann als obligat biotropher Parasit nur auf lebendigen Blättern seines Wirtsorganismus d.h. der Weinrebe dauerhaft kultiviert werden. Seine Sporen (Konidien) sind stark wasserhaltig und können deshalb nicht mit den üblichen Methoden zur Lagerung eingefroren werden. Zur Kultivierung verschiedener Mehltauisolate wurden zwei Methoden etabliert: Die eine Methode bestand in der Kultivierung von Oidium auf abgeschnittenen Blättern der Rebsorte Trollinger in Petrischalen. Die Kulturen waren so zwei bis drei Wochen haltbar. Auf diese Weise wurden größere Mengen an Konidien produziert werden, die als Inokulum für Freilandversuche oder zur Gewinnung von DNA für die molekulargenetische Charakterisierung verwendet wurden.

Zur dauerhaften Erhaltung von Oidium-Isolaten, wurde eine weitere Methode etabliert. Oidiumisolate wurden auf sterilen Einaugenstecklingen der Rebsorte Trollinger in Dauerkultur genommen. Die Einaugenstecklinge wurden zunächst in Magentagefäßen auf Nähr-Agar kultiviert, dem Vitamine, Pflanzensalze und Hormone beigefügt worden waren. Nach ca. 8 Wochen waren sie groß genug, um unter der Sterilbank mittels bereits sporulierender Blattstückchen mit Oidium infiziert zu werden. Bei 12°C im Thermostaten unter einer Aquarienleuchte waren die Kulturen dann 3 bis 6 Monate haltbar.

Sammeln von Isolaten

In den Jahren 1998 bis 2000 wurden keine Fälle bekannt, in denen an den hauptsächlich beobachteten Sorten Regent und Johanniter ein außergewöhnlicher Oidiumbefall aufgetreten ist. Es wird deshalb davon ausgegangen, dass die Gefahr eines Zusammenbrechens der Resistenz gegen Oidium im Gegensatz zu Plasmopara viticola relativ gering sein dürfte. Dieser Erreger wurde deshalb nicht mehr weiter verfolgt. Die Methodik wurde jedoch verwendet, um Stämme zu archivieren, die wegen einer möglichen Resistenz gegen Fungizide aufgefallen sind.

Plasmopara viticola - (Rebenperonospora)

Sammeln von Isolaten, Vermehrung und Konservierung

Pilzisolate von Peronospora wurden in Form einzelner Ölflecken gesammelt, zur Sporulation gebracht und auf frischen Blättern der jeweiligen Rebsorte im Labor vermehrt. Trocken abgeerntete Sporangien konnten bei –20° C für mindestens 2 Jahre gelagert werden.

In den Jahren 1998 und 1999 wurden jeweils 48 Isolate von Primärinfektionen und 48 Isolate von Sekundärinfektionen gesammelt. Während im Jahr 1998 kein besonders auffälliges Vorkommen von Peronospora auf resistenten Rebsorten entdeckt wurde, wurden 1999 viele solcher Fälle gemeldet. Im Jahr 1999 konnten 24 derartige Isolate von 5 verschiedenen Standorten in der Schweiz und in Baden-Württemberg gesammelt werden.

Untersuchungen zur Virulenz von Plasmopara-Isolaten

Ziel der Untersuchung war es, zu überprüfen, ob bestimmte besonders virulente Isolate des Erregers des falschen Mehltaupilzes, Plasmopara viticola, in der Lage sind, sich langfristig an resistente Rebsorten wie Johanniter und Regent anzupassen. Alle Kollegen in Deutschland und der Schweiz wurden gebeten, uns Fälle mit besonders starkem Befall durch Peronospora zu melden.

5 der 24 gesammelten Isolate von 5 verschiedenen Standorten aus der Schweiz und Baden-Württemberg von den Rebsorten Regent und Johanniter, die sich in Vortests als besonders aggressiv erwiesen, konnten im Labor vermehrt und archiviert werden: Von Regent We 06, We 10 und We 11, von Johanniter We 07 und We 08. Im Jahr 2000 wurde ein weiterer Stamm von einer fast vollständig vernichteten Anlage der Rebsorte Regent aus Gundelsheim (Württemberg) isoliert.

In einem Labortest auf Blattscheiben wurde 1999 und 2000 getestet, ob sich bestimmte besonders virulente Isolate, auf Rebsorten wie Regent und Johanniter besser etablieren können als ein Isolat, das von Trollinger isoliert worden war. Zum Vergleich wurde ein Isolat We 03, das im Jahre 1995 von der Rebsorte Trollinger in Weinsberg isoliert worden war, verwendet.

Versuchsdurchführung:
(nach Standard-Arbeitsanweisung „SOP Blattscheibentest" der LVWO Weinsberg)

Blattmaterial:
Blattscheiben 3,3 cm Ø von unbehandelten Reben, die im Gewächshaus angezogen worden waren

Inokulum:  
Infektionssuspension: 20.000 Sporangien/ml
Infektionsmenge: 0,07 ml/cm²
Applikation mit Laborsprühgerät (Kugler Applikationsschlitten)

Lagerung der Blattscheiben:

Bei Raumtemperatur (18° C) auf feuchtem Filterpapier bei 100 % Luftfeuchte
1.200 l x
Photoperiode 12 Std.

Auswertung:  
Schätzen der befallenen Blattfläche in % 8 Tage nach der Infektion (weißer Pilzrasen).

Versuchsumfang/Wiederholungen:
15 Blattschieben je Wiederholungen
4 Versuchswiederholungen zeitlich versetzt

Ergebnisse:

Das von Trollinger isolierte Vergleichsisolat We 03 zeigte erwartungsgemäß auf Trollinger einen starken Befall von 54%, auf Johanniter 23 % und auf Regent hingegen nur einen Befall von 12%. Diese Relationen entsprechen dem normalen Verhalten dieser Sorten im Freiland. Trollinger ist extrem anfällig, Johanniter besitzt eine mittlere Resistenz und Regent eine normalerweise sehr hohe Resistenz. Im Labortest erwiesen sich insbesondere die Isolate We 10 und We 11, die von Regent isoliert worden waren, als besonders aggressiv. Das Isolat We 10 verursachte auf Regent mit 65% Befall fast den gleichen Befallsgrad auf wie auf der empfindlichen Rebsorte Trollinger (69%) und zeigte auch auf der Rebsorte Johanniter einen starken Befall (49%). Nicht ganz so ausgeprägt war der Befall der resistenten Sorten bei dem Isolat We 11. Der ebenfalls von Regent isolierte Stamm We 06 zeigte hingegen keinen erhöhten Befall auf Regent. Vermutlich war sein Vorkommen auf Regent allein auf das besonders günstige Wetter für eine Pilzinfektion im Jahre 1999 in Südbaden zurückzuführen. Die Isolate We 07 und We 08, die von Johanniter isoliert worden waren, wiesen auf Johanniter einen Befall von ca. 40%, auf Regent hingegen nur einen mäßigen Befall von ca. 20% auf.

Sehr wahrscheinlich ist die Resistenzeigenschaft der Rebsorte Regent teilweise rassenspezifisch und damit möglicherweise nicht dauerhaft. So könnten sich in befallsstarken Jahren Plasmopara-Isolate durchsetzen, die sich auch auf resistenten Rebsorten gut entwickeln.

Abbildung: Durch die verschiedenen Isolate befallene Blattfläche bei den Sorten Trollinger, Johanniter und Regent

 

2.2.1 Charakterisierung der Stämme mit RAPD-PCR

In Zusammenarbeit mit der Fachhochschule Heilbronn wurden Molekulargenetische Untersuchungen mittels RAPD-PCR durchgeführt. Es zeigte sich, dass die 1999 auf resistenten Rebsorten isolierten Stämme trotz unterschiedlicher Herkunft ein ähnliches Bandenmuster aufwiesen. Ob ein solches Fingerprint-Muster als Marker für besonders virulente Stämme eventuell dienen könnte, wird noch geprüft.

2.2.2 Fortführung der Untersuchungen zur Virulenz von Plasmopara-Isolaten

Weitere Untersuchungen über die Verbreitung des Plasmopara-Typs We 10 und zu dessen Verhalten im Freiland sind geplant. Dabei sollen 2 Isolate 1 : 1 gemixt und deren kompetitives Verhalten im Gewächshaus und im Freiland verfolgt werden. In diesem Fall wird die Projektzusammenarbeit auf die ETH Zürich (Professor Dr. Gessler) ausgedehnt werden, die über eine zweite Identifikationstechnologie zur Charakterisierung interessanter Stämme mit molekularbiologischen Methoden verfügt (Satelliten-Technik).

Untersuchungen zur genetischen Variabilität von Peronospora

In Zusammenarbeit mit der Fachhochschule Heilbronn wurden 1998 und 1999 Untersuchungen zur genetischen Variabilität von Peronospora mit Hilfe molekulargenetischer Methoden (PAPD-PCR-Technik) durchgeführt. Es sollte überprüft werden, ob sich die genetische Variabilität im Laufe der Vegetationsperiode verändert und eine Anpassung der Isolate an die Umweltbedingungen (Rebsorten, Wetter) stattfindet.

Untersucht wurden jeweils ca. 50 Primärinfektionen aus Wildeck. Sie wurden von Blättern der Rebsorten Müller-Thurgau, Traminer und Weißburgunder isoliert. Diese Primärinfektionen wiesen eine hohe Variabilität auf. Im Oktober wurde an den gleichen Standorten von den gleichen Rebstöcken jeweils ca. 50 Sekundärinfektionen gesammelt und ebenfalls mittels RAPD-PCR-Technik untersucht. Es zeigte sich, dass die genetische Variabilität der Sekundärinfektionen stark eingeschränkt war, was auf eine Selektion bestimmter Isolate unter den gegebenen Umweltbedingungen schließen lässt. Sortenunabhängig setzten sich bestimmte Isolat-Typen durch.

Untersuchungen zur Heterokaryose bei Peronospora

Im August 1998 wurden von drei Peronospora-Isolaten, die von der Rebsorte Müller- Thurgau isoliert worden waren, Einsporangienisolate hergestellt und mittels RAPD-PCR-Technik molekulargenetisch untersucht. Ein weiterer Schritt bestand in der Gewinnung von Einzoosporenisolaten aus den Einsporangienisolaten. Die genetische Charakterisierung mittels PCR-Technik zeigte, dass zwei genetisch unterschiedliche Zoosporentypen in einem Sporangium vorhanden sein können. Dies weist auf eine mögliche Heterokaryose bei Peronospora hin. Auf diese Weise können neue Erkenntnisse über die Genetik des Peronospora-Pilzes gewonnen werden. Bisher ist noch unbekannt, wie nach den normalerweise homokaryotischen Primärinfektionen hetrokaryotische Stämme entstehen. Der Vorgang könnte wesentliche Bedeutung auch für die Entstehung besonders aggressiver Rassen haben.

Abschätzung des Risikos des Durchbrechens der Resistenz

Bei Oidium liegen bisher keinerlei Hinweise auf eine Gefahr des Durchbrechens der Resistenz vor.

Bei Peronospora sind zumindest einzelne Fälle extremen Befalls an normalerweise resistenten Sorten auf das Auftreten genetisch besonders adaptierter Rassen des Erregers zurückzuführen. Langfristig besteht die Gefahr, dass sich entsprechende Gene in der Population allmählich anreichern und dass die Häufigkeit solcher Fälle somit zunimmt. Bei der Sorte Regent dürfte die Gefahr relativ hoch sein, weil bei dieser Rebsorte die größte Variabilität der Befallsintensität bei verschiedenen Rassen des Erregers vorkommt. Die Rebsorte Johanniter dürfte nach bisherigem Kenntnisstand weniger gefährdet sein. Obwohl ihre Resistenz bei Befall durch „normale" Erregerrassen geringer ausgeprägt ist als die der Sorte Regent, wurden nur wenige Fälle starken Befalls gefunden. Die Variabilität der Rassen ist auf dieser Sorte deutlich geringer.

Nutzung der Isolate

Regent als bisher erfolgreichste pilresistente Rotwein-Rebsorte wird häufig als Kreuzungspartner bei der Züchtung neuer Rebsorten verwendet. Dabei besteht die Gefahr, dass neue Sorten ebenfalls eine nicht dauerhafte Resistenz erben. Die entdeckten Regent-spezifischen Isolate, insbesondere WE 10/3 werden seit dem Jahr 2000 zur Infektion der Sämlinge der Rebenzüchtung der LVWO Weinsberg verwendet. Damit sollen gezielt Sämlinge ausgelesen werden, die gegen diese Rassen zusätzliche oder andere Resistenzgene tragen. Bei verbreitetem Anbau von pilzresistenten Sorten wäre der Einsatz einer größeren Anzahl von Sorten mit unterschiedlicher Resistenzstruktur das beste Mittel, die Resistenz aller Sorten dauerhaft zu erhalten.

 

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